Kit cualitativo de uso en investigación para la amplificación por RT-PCR del genoma completo del VIH-1 a partir de muestras de plasma o suero positivas para VIH-1. Tras la amplificación, la secuenciación de próxima generación (Next Generation Sequencing, NGS) permite realizar el genotipado viral y evaluar mutaciones presentes en el genoma del virus.
3.- Descripción Detallada
Principio de funcionamiento
El kit AD4SEQ HIV-1 Whole Genome se basa en la amplificación mediante RT-PCR del ARN viral completo del VIH-1 obtenido a partir de muestras humanas de plasma o suero. El producto amplificado se procesa posteriormente para su secuenciación mediante NGS, lo que permite genotipar el virus e identificar mutaciones presentes en el genoma viral, incluidas las situadas en regiones diana de referencia.
El procedimiento analítico descrito incluye una secuencia de trabajo formada por: manipulación y extracción del ARN, One Step RT-PCR Target, purificación de los productos de RT-PCR, PCR TAG, purificación de PCR TAG, PCR Index, purificación de PCR Index, normalización y preparación del pool de muestras, secuenciación en plataformas Illumina® y análisis de datos.
Aplicaciones clínicas / uso previsto en investigación
El producto está indicado solo para uso en investigación (R.U.O.) y puede utilizarse en muestras de plasma o suero positivas para VIH-1. Su finalidad es investigar el escenario completo de mutaciones virales presentes en muestras positivas para VIH-1, mediante genotipado del virus y evaluación de mutaciones en el genoma viral.
La documentación destaca la relevancia de evaluar mutaciones en el genoma del VIH-1 para el éxito de los tratamientos antirretrovirales. Además de regiones clásicas como proteasa, transcriptasa inversa, integrasa y V3Loop, el kit permite investigar regiones virales adicionales como gag, vif, nef y regiones adyacentes a la integrasa.
Beneficios
Permite el análisis del genoma completo del VIH-1 mediante una estrategia basada en RT-PCR y NGS.Facilita el genotipado viral y la identificación de mutaciones presentes en regiones de interés del genoma.Amplía la investigación más allá de proteasa, transcriptasa inversa, integrasa y V3Loop, incluyendo regiones como gag, vif, nef y regiones adyacentes a integrasa.El folleto técnico del producto indica como prestaciones la preparación de librerías para secuenciación en 8 horas, input recomendado ≥1000 cp/ml, genotipado de subtipos del grupo M de VIH-1 incluidos recombinantes, detección de farmacorresistencias, análisis de tropismo de VIH-1 en gp120 y análisis mediante software dedicado.
Resultados o indicadores clave
Es posible identificar mutaciones hasta el 1% con una cobertura de 3000x.Para obtener una buena cobertura de todas las regiones virales amplificadas, se recomienda disponer de aproximadamente 120.000 reads por muestra.El análisis de datos se realiza a partir de archivos fastqs obtenidos tras la secuenciación NGS. Se recomienda el uso del software SmartVir, producido por SmartSeq s.r.l., o programas similares capaces de genotipar el genoma completo del VIH-1 e identificar codones mutados.El resultado de los métodos de análisis sugeridos se expresa como valor de abundancia relativa de las mutaciones presentes en la muestra.SmartVir establece un umbral mínimo de cobertura por codón de 100 reads; también pueden evaluarse codones con menor cobertura, hasta un mínimo configurable de 30 reads, considerando fiables las mutaciones con una cobertura mínima de 30 reads.
Tecnología utilizada
El kit combina amplificación del ARN viral por One Step RT-PCR, preparación posterior mediante PCR TAG y PCR Index, purificación con perlas magnéticas AMPure® Beads XP, normalización y pooling de librerías, y secuenciación mediante plataformas Illumina®.
Las plataformas Illumina® indicadas en la documentación son MiSeq™, MiniSeq™, iSeq™ 100 y MiSeq™ i100, con diferentes kits de reactivos, números máximos de muestras y tiempos de secuenciación según plataforma.
Público/usuario previsto
El kit R.U.O. debe ser utilizado por personal cualificado y debidamente formado, con el fin de evitar un rendimiento inadecuado derivado de errores en la dispensación de muestras o reactivos, o de una configuración incorrecta del secuenciador.
Consideraciones o limitaciones
Producto solo para uso en investigación (R.U.O.).El kit puede utilizarse en muestras de plasma o suero positivas para VIH-1.Se recomienda trabajar con muestras con carga viral ≥1000 cp/ml; para cargas inferiores, la documentación remite a instrucciones específicas y a consultar con el especialista local.El kit no contiene reactivos para la extracción del ARN genómico viral; la extracción debe realizarse con métodos recomendados o validados por el usuario.La presencia de EDTA a concentraciones superiores a 2 mM puede inhibir la reacción de amplificación posterior.La fiabilidad de los resultados puede verse influida por la recogida, transporte, almacenamiento y procesamiento de la muestra.El kit está destinado a uso exclusivamente manual; cualquier automatización debe ser validada por el usuario.
4.- Aspectos Clave
Kit cualitativo para análisis del genoma completo del VIH-1.
Basado en RT-PCR seguida de secuenciación NGS.
Permite genotipado viral y evaluación de mutaciones del genoma del VIH-1.
Aplicable a muestras de plasma o suero positivas para VIH-1.
Investigación de regiones virales relevantes como gag, vif, nef y regiones adyacentes a integrasa.
Compatible con plataformas Illumina® MiSeq™, MiniSeq™, iSeq™ 100 y MiSeq™ i100.
Posibilidad de identificar mutaciones hasta el 1% con cobertura de 3000x.
Recomendación de aproximadamente 120.000 reads por muestra para buena cobertura.
Análisis de datos recomendado mediante SmartVir o software equivalente.
Producto R.U.O., destinado exclusivamente a investigación.
5.- Detalles de Presentación
Formato y referencia
Producto
HIV-1 Whole Genome
Línea
AD4SEQ
Referencia
AD-012.030
Presentación
30 reacciones
Uso
R.U.O. / Solo para uso en investigación
Contenido del kit
WG Px Mix 1: 40 µl, mezcla de oligonucleótidos para amplificación del genoma viral.WG Px Mix 2: 40 µl, mezcla de oligonucleótidos para amplificación del genoma viral.WG Px Mix 3: 40 µl, mezcla de oligonucleótidos para amplificación del genoma viral.WG Px Mix 4: 40 µl, mezcla de oligonucleótidos para amplificación del genoma viral.WG RT Mix: 80 µl, solución con mezcla de enzimas para One Step RT-PCR.WG 2X Master Mix: 1000 µl, solución buffer para One Step RT-PCR.TAG Mix: 33 µl, solución con mezcla de enzimas para PCR TAG.2X Reaction Buffer: 300 µl, solución buffer para PCR TAG.STB: 1000 µl, solución buffer post PCR TAG.Index Mix: 330 µl, solución con mezcla de enzimas para PCR Index.iPLATE_i193_i224_WGS: 32 índices, mezcla de oligonucleótidos para indexado de muestras amplificadas por PCR.
Conservación y estabilidad
Conservar todos los reactivos entre -25 °C y -15 °C.Los componentes son listos para usar y estables hasta la fecha de caducidad indicada si se almacenan según las recomendaciones.Los reactivos pueden someterse a un máximo de 4 ciclos de congelación/descongelación sin comprometer su funcionalidad.Durante el uso, los reactivos deben mantenerse en hielo o en racks refrigerados entre +2 °C y +8 °C.Los reactivos no son reutilizables y no deben conservarse restos de mezclas intermedias.
