AD4SEQ HBV Solution

Kit cualitativo in vitro para la determinación del genotipo del virus de la hepatitis B (HBV) y la identificación de mutaciones de resistencia a fármacos mediante amplificación por PCR de dos regiones virales seguida de secuenciación NGS. Está destinado a muestras de plasma o suero positivas para HBV.

Descripción Detallada

Principio de funcionamiento

El kit se basa en la amplificación por PCR de dos regiones del ADN viral del HBV con papel clave en el genotipado y en el desarrollo de resistencias: Reverse Transcriptase (RT) y preCore (pC), seguida de secuenciación masiva (NGS).

Las regiones amplificadas abarcan RT: codones 1 – fin y preCore: codones 1 – fin.

Tras la secuenciación, los datos pueden analizarse con software dedicado que consulta bases de datos de referencia para devolver un informe con el genotipo viral, las mutaciones identificadas y las resistencias asociadas.

El diagrama de flujo de la página 3 del folleto resume el proceso analítico: extracción de ADN genómico viral, amplificación Target PCR, control de calidad, purificación con AMPure XP, TAG PCR, Index PCR, normalización de librería, secuenciación NGS y análisis de datos.

Aplicaciones clínicas

El producto está orientado a la determinación del genotipo viral y a la identificación de mutaciones de resistencia a fármacos del HBV en muestras positivas. El documento de base indica que la secuenciación NGS es una técnica apropiada para el genotipado del HBV y para el cribado de mutaciones de resistencia.

Beneficios

Analiza en un mismo flujo de trabajo dos regiones relevantes del genoma viral asociadas al genotipado y a la resistencia terapéutica: RT y preCore. Permite combinar amplificación, secuenciación y análisis bioinformático en un procedimiento estandarizado. Puede secuenciarse en varias plataformas Illumina, lo que facilita su integración en distintos entornos de laboratorio. El folleto indica preparación de la librería de secuenciación en aproximadamente 6 horas y un flujo completo de trabajo de hasta 24 horas, según el esquema de la página 3.

Resultados o indicadores clave

Muestras recomendadas: plasma y suero positivos para HBV. LOD: ≥ 500 IU/ml. Para muestras con viremia inferior, contactar con Customer Service. Para obtener buena cobertura de todas las regiones amplificadas, se recomiendan aproximadamente 40.000 lecturas por muestra. El documento indica que es posible identificar mutaciones al 1% con una cobertura de 3000x. En el control de calidad de los productos de Target PCR, se esperan bandas de aproximadamente 1200 pb para Amp Mix A y 1000 pb para Amp Mix B. En el control de calidad de los productos de Index PCR, se esperan fragmentos de aproximadamente 375 pb. El software recomendado establece automáticamente un umbral mínimo de cobertura de 1000 lecturas; también pueden evaluarse codones con una cobertura inferior, con un mínimo configurable de 30 lecturas.

Tecnología utilizada

Amplificación por PCR de ADN viral genómico y secuenciación NGS. Purificación con AMPure XP, indexación de muestras y secuenciación en plataformas Illumina MiSeq, MiniSeq, iSeq 100 o MiSeq i100. El análisis de los archivos FASTQ se recomienda con SmartVir, desarrollado por SmartSeq s.r.l., o software equivalente capaz de genotipar HBV e identificar mutaciones en las regiones secuenciadas.

Público/usuario previsto

Uso en muestras de plasma o suero positivas para HBV. Kit RUO, para uso por personal cualificado y adecuadamente entrenado.

Consideraciones o limitaciones

El kit es de uso manual exclusivo; cualquier automatización debe ser validada por el usuario. No incluye reactivos para la extracción de ADN viral. Requiere reactivos y equipamiento adicionales, incluidos AMPure XP, kits de secuenciación Illumina, PhiX y el instrumental de laboratorio correspondiente. Los reactivos deben almacenarse entre -25 °C y -15 °C, admiten un máximo de 4 ciclos de congelación/descongelación y, durante el uso, deben mantenerse entre +2 °C y +8 °C. Para un buen rendimiento de extracción y análisis NGS se recomienda emplear muestras almacenadas por debajo de -65 °C y sin ciclos de congelación/descongelación. La presencia de EDTA por encima de 2 mM puede inhibir la amplificación posterior. Las bandas del Target PCR pueden no visualizarse claramente, especialmente en muestras con viremia muy baja.

Otra información técnica relevante

El protocolo analítico comprende 10 etapas: extracción/manipulación de ADN, Target PCR, purificación, TAG PCR, purificación, Index PCR, purificación, normalización y pool, secuenciación y análisis de datos. Según la plataforma y el kit de secuenciación, el sistema admite desde hasta 30 muestras en MiSeq Nano Kit v2 hasta hasta 96 muestras en MiSeq Micro Kit v2, MiniSeq Mid Output, iSeq 100 i1 o MiSeq i100 Series 5M. Para muestras con baja cobertura, el documento indica que si se alcanza una cobertura mínima de 100X por región no es necesario resecuenciar; si algunos codones quedan por debajo de 100 lecturas, debe evaluarse si repetir la secuenciación o emitir el informe.

Aspectos Clave

Genotipado de HBV e identificación de mutaciones de resistencia a fármacos.

Amplificación de dos regiones diana: Reverse Transcriptase y preCore.

Uso en muestras de plasma/suero positivas para HBV.

LOD ≥ 500 IU/ml.

Compatible con Illumina MiSeq, MiniSeq, iSeq 100 y MiSeq i100.

Preparación de librería en aproximadamente 6 horas y flujo de trabajo total de hasta 24 horas, según el esquema del folleto.

Análisis bioinformático con software recomendado SmartVir.

Presentación RUO para 30 reacciones.

Detalles de Presentación

Formato y Referencia

AD-004.030

Kit para 30 reacciones

Contenido del kit

Amp Mix A (insert rojo): 1 x 36 µl. Mezcla de oligonucleótidos para la amplificación de la región Reverse Transcriptase del HBV. Amp Mix B (insert blanco): 1 x 36 µl. Mezcla de oligonucleótidos para la amplificación de la región preCore del HBV. Target Mix (tapón naranja): 1 x 720 µl. Solución con la mezcla enzimática para Target PCR. Tag Mix (insert negro): 1 x 33 µl. Solución con la mezcla enzimática para la digestión del ADN viral. 2X Reaction Buffer (insert morado): 1 x 300 µl. Tampón para la reacción de digestión. STB (tapón azul): 1 x 1000 µl. Tampón para la reacción de digestión. Enzyme Mix 6 (tapón amarillo): 1 x 360 µl. Solución con la mezcla enzimática para Index PCR. iPLATE_i97_i128_HBV: 1 x 32 índices para indexación.

Material necesario no incluido

Kit de extracción de ADN viral, AMPure XP, kit de secuenciación Illumina compatible, PhiX Control v3, agua grado biología molecular, etanol y equipamiento de laboratorio específico, incluido termociclador y secuenciador Illumina compatible.

Área:

Microbiología, Virus

Tecnología:

Secuenciación masiva (NGS)

Marca:

Arrow Diagnostics

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