AD4SEQ HCV Solution (HCV Solution)

Kit estandarizado para la detección del genotipo del virus de la hepatitis C (HCV) y la determinación de resistencias a fármacos mediante secuenciación masiva (NGS) del genoma viral. Está destinado exclusivamente a muestras de plasma o suero positivas para HCV y se complementa con software dedicado para la visualización y el análisis informático de los datos obtenidos.

3.- Descripción Detallada

Principio de funcionamiento

El kit se basa en una estrategia de RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) seguida de secuenciación NGS del genoma viral del HCV a partir de una muestra biológica. Emplea sondas pangenotípicas y específicas de genotipo en distintas fases del protocolo para amplificar simultáneamente los principales genotipos virales. La amplificación WG permite secuenciar aproximadamente el 90% del genoma del HCV, desde la región 5’UTR hasta el codón 346 de NS5B. La amplificación adicional de la región MIDI amplía la cobertura hasta aproximadamente el 97% del genoma, desde 5’UTR hasta 3’UTR.

Tras la secuenciación, los archivos FASTQ pueden analizarse con software dedicado, con recomendación expresa de SmartVir (desarrollado por SmartSeq s.r.l.), para indicar genotipo de HCV y identificar codones mutados en las regiones diana.

Aplicaciones clínicas

Su utilidad situase en la caracterización genotípica del HCV y en la evaluación de resistencias asociadas a fármacos. Señala la importancia de definir el genotipo viral antes de iniciar terapia, volver a definirlo en pacientes con fracaso terapéutico a antivirales de acción directa (DAA) e identificar resistencias farmacológicas asociadas.

Beneficios

Integra en un mismo flujo de trabajo la amplificación del genoma viral, la secuenciación NGS y el análisis bioinformático posterior. Permite la identificación de genotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7, así como de subtipos, junto con la evaluación de resistencias asociadas a fármacos en las regiones secuenciadas. Es compatible con múltiplas plataformas Illumina, facilitando su integración en distintos entornos de secuenciación.

Resultados o indicadores clave

Cobertura de hasta el 97% del genoma del HCV con la estrategia completa WG + MIDI. LOD recomendado: ≥ 1000 UI/ml en plasma o suero. Para muestras con viremia inferior, contactar con servicio técnico. Para obtener buena cobertura de todas las regiones amplificadas, se recomiendan aproximadamente 200.000 lecturas por muestra. El documento indica que es posible identificar mutaciones al 1% con una cobertura de 3000x. El software SmartVir establece automáticamente un umbral mínimo de 1000 lecturas; también permite evaluar codones con coberturas inferiores, con un mínimo configurable de 30 lecturas.

Tecnología utilizada

RT-PCR para retrotranscripción y amplificación, seguida de Whole Genome Sequencing (WGS) mediante NGS. Purificación con AMPure XP, indexación de muestras y secuenciación en Illumina MiSeq, MiniSeq, iSeq 100 o MiSeq i100.

Público/usuario previsto

Uso exclusivo en muestras de plasma o suero positivas para HCV. Kit RUO, destinado a ser utilizado por personal cualificado y adecuadamente entrenado.

Consideraciones o limitaciones

Es un kit de uso manual exclusivo; cualquier automatización debe ser validada por el usuario. No incluye reactivos para la extracción de ARN viral y requiere reactivos, consumibles y equipamientos adicionales para completar el flujo de trabajo. Los reactivos deben almacenarse entre -25 °C y -15 °C; admiten un máximo de 4 ciclos de congelación/descongelación y, durante el uso, deben mantenerse en hielo o entre +2 °C y +8 °C. La fiabilidad de los resultados puede verse afectada por la toma, transporte, almacenamiento y procesamiento de la muestra. El ARN extraído debe conservarse por debajo de -65 °C y se recomienda evitar ciclos de congelación/descongelación. Además, concentraciones de EDTA > 2 mM pueden inhibir la amplificación. En muestras con viremia inferior a 500.000 UI/ml puede no visualizarse la banda WG en el control de calidad, aunque el protocolo recomienda continuar con las fases posteriores.

Otra información técnica relevante

El protocolo analítico contempla 11 etapas: manipulación/extracción de ARN, RT-PCR, Target PCR, purificaciones intermedias, TAG PCR, Index PCR, normalización y preparación del pool, secuenciación y análisis de datos.

Según la plataforma y el reactivo de secuenciación empleado, el sistema admite desde hasta 10 muestras en MiSeq Nano v2 (300 ciclos) hasta 75 muestras en MiniSeq Mid Output (300 ciclos).

4.- Aspectos Clave

Genotipado del HCV y determinación de resistencias a fármacos mediante NGS.

Cobertura de hasta el 97% del genoma viral con estrategia WG + MIDI.

Identificación de genotipos 1-7 y subtipos.

Uso exclusivo en plasma/suero positivo para HCV, con LOD recomendado ≥ 1000 UI/ml.

Compatible con plataformas Illumina MiSeq, MiniSeq, iSeq 100 y MiSeq i100.

Análisis de datos con software dedicado recomendado SmartVir.

Presentación RUO de uso manual para 30 reacciones.

5.- Detalles de Presentación

Formato y referencia

AD-006.030

Presentación para 30 reacciones

Contenido del kit

Amp Mix RT (insert verde): 80 µl dNTPs Solution (tapón naranja): 40 µl RT Mix (insert transparente): 40 µl RT Buffer (5X) (tapón amarillo): 160 µl DTT Solution (tapón blanco): 40 µl Amp Mix WG (insert azul): 64 µl Amp Mix MIDI (insert rojo): 400 µl Target Mix HCV (tapón marrón): 1400 µl TAG Mix (insert negro): 33 µl 2X Reaction Buffer (insert morado): 300 µl STB (tapón azul): 1000 µl Index Mix (tapón negro): 330 µl iPlate_i129_i160_HCV: 1 x 32 índices para indexación de productos PCR

Material necesario no incluido

Reactivos para extracción del ARN viral, AMPure XP, kits de secuenciación Illumina compatibles, PhiX Control v3, agua de biología molecular, etanol y equipamiento específico de laboratorio, incluyendo termociclador y secuenciador Illumina compatible.

Área:

Microbiología, Virus

Tecnología:

Secuenciación masiva (NGS)

Marca:

Arrow Diagnostics

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