Kit de diagnóstico in vitro basado en PCR y secuenciación masiva (NGS) para la evaluación cualitativa del microbioma mediante el análisis de regiones hipervariables del gen bacteriano 16S rDNA. Está diseñado para microbiota intestinal humana y otras muestras biológicas, y puede utilizarse como ayuda al diagnóstico en el contexto clínico del trasplante de microbiota fecal, tanto en el seguimiento del paciente como en el cribado de donantes.
3.- Descripción Detallada
Principio de funcionamiento
El sistema se basa en la amplificación por PCR de las regiones hipervariables del gen bacteriano 16S rDNA mediante cebadores degenerados, seguida de secuenciación NGS, lo que permite identificar poblaciones bacterianas presentes en la muestra sin necesidad de cultivo.
La región analizada depende del kit:
Microbiota Solution A (AD-001.024): regiones V1-V2-V3
Microbiota Solution B (AD-002.024): regiones V3-V4-V6
Tras la secuenciación, los datos pueden analizarse automáticamente mediante software para identificar las especies presentes en una muestra individual o en muestras comparativas seleccionadas por el usuario.
Aplicaciones clínicas
Evaluación cualitativa del microbiota intestinal humana y de otras muestras biológicas, incluyendo hisopo vaginal, catéter endometrial, esputo, hisopo cutáneo, saliva, heces e hisopo rectal.
Puede emplearse como ayuda al diagnóstico en el contexto clínico del trasplante de microbiota fecal, tanto para el seguimiento postratamiento como para el cribado de donantes.
Beneficios
Permite identificar poblaciones bacterianas evitando la fase de cultivo y, potencialmente, sin el sesgo selectivo introducido por las condiciones de cultivo en laboratorio.
Proporciona un enfoque estandarizado para el análisis clínico del microbiota, útil para identificar perfiles bacterianos ya asociados a patologías específicas y para detectar nuevos perfiles bacterianos.
Preparación de librerías en 8 horas y un flujo de trabajo total de hasta 24 horas.
Resultados o indicadores clave
Especificidad analítica: en 10 extractos de ADN bacteriano procedentes de 10 muestras de suelo, ninguna de las especies diana evaluadas fue detectada; el documento informa NPA (Negative Percent Agreement) = 100%.
Sensibilidad analítica: capacidad para identificar especies bacterianas presentes en la muestra en un porcentaje ≥0,16%, bajo las condiciones de cobertura indicadas en el estudio interno.
Reproducibilidad: los criterios de aceptación se cumplieron con CV intra-run < 10%, CV inter-run < 15% y CV inter-lot < 15%; el documento concluye que los resultados son altamente replicables.
Rendimiento clínico: en una comparación con el procedimiento estándar de Illumina para microbiota intestinal humana, se analizaron 7 muestras de heces por triplicado (total 21 muestras), concluyéndose que Microbiota Solution A y Microbiota Solution B son comparables a los datos obtenidos con el protocolo sugerido por Illumina.
En el control de calidad de la PCR Target se esperan amplicones de aproximadamente 650 bp para Solution A y 840 bp para Solution B.
Para la normalización de librerías, el documento utiliza como referencia longitudes medias de 640 bp para el kit con Amp Mix V1-V3 y 900 bp para el kit con Amp Mix V3-V6.
Tecnología utilizada
Amplificación de ADN por PCR de regiones hipervariables del 16S rDNA y secuenciación NGS.
El protocolo analítico comprende 8 fases: extracción y cuantificación de ADN, PCR Target, purificación de productos Target, PCR Index, purificación de productos Index, normalización y preparación del pool, secuenciación y análisis de datos.
La secuenciación se realiza en la plataforma MiSeq® de Illumina con MiSeq Reagent Nano Kit v2 (500-cycles). Para la carga de librería, el documento recomienda 7 pM para el kit AD-001.024 y 5 pM para el kit AD-002.024, ajustando además la muestra con 10% de PhiX Control v3.
El análisis de datos se recomienda con el software MicrobAT (SmartSeq s.r.l.) o software similar capaz de asignar la mayoría de las lecturas hasta nivel taxonómico de especie y devolver estadísticas descriptivas como curva de rarefacción, alfa-diversidad, índice de disbiosis y enterotipo en muestras fecales.
Público/usuario previsto
Producto para uso profesional.
El documento indica que debe ser utilizado por personal cualificado y adecuadamente entrenado.
Consideraciones o limitaciones
El kit es de uso manual exclusivo; cualquier automatización debe ser validada por el usuario.
Las muestras recomendadas globalmente son: heces, hisopo rectal, hisopo vaginal, catéter endometrial, hisopo cutáneo, esputo y saliva. Para una identificación correcta hasta nivel de especie, el documento recomienda:
Solution A: muestra cutánea, esputo y saliva
Solution B: heces, hisopo rectal, hisopo vaginal y catéter endometrial
Si se utiliza Microbiota Solution A con muestras de hisopo vaginal o catéter endometrial, no será posible identificar a nivel de especie el género Gardnerella spp.
El análisis de microbiota puede realizarse potencialmente sobre otros tipos de muestra biológica, pero en ese caso tanto el uso del kit como el método de extracción de ADN deben ser validados por el usuario.
Para las reacciones posteriores se requieren 5 µl de una solución de ADN a 1 ng/µl. Si la concentración es inferior, puede usarse la muestra tal cual, verificando que el ADN esté eluído en agua grado molecular o en un tampón sin EDTA, ya que concentraciones superiores a 2 mM pueden inhibir la amplificación.
Los resultados de análisis expresan abundancia relativa de las especies detectadas y no pueden interpretarse como cantidad absoluta. El documento recomienda interpretar siempre el perfil microbiano junto con la historia clínica y otros datos diagnósticos disponibles.
4.- Aspectos Clave
Evaluación cualitativa del microbioma mediante PCR del 16S rDNA y secuenciación NGS.
Dos configuraciones según la región diana:
Solution A: V1-V2-V3
Solution B: V3-V4-V6
Indicado para microbiota intestinal y otras matrices biológicas recomendadas.
Uso como ayuda diagnóstica en trasplante de microbiota fecal: seguimiento y cribado de donantes.
NPA = 100% en la evaluación de especificidad analítica descrita en el documento.
Resultados con alta reproducibilidad bajo los criterios de CV definidos por el fabricante.
Preparación de librería en 8 horas y workflow de hasta 24 horas, según el folleto.
Análisis bioinformático recomendado con MicrobAT.
5.- Detalles de Presentación
Formato
| Kit | Para 24 reacciones. |
Referencias
| AD-001.024 | Microbiota Solution A |
| AD-002.024 | Microbiota Solution B |
Contenido del kit
Enzyme Mix 1 (tapón rojo): 1 x 340 µl. Mezcla de enzimas para PCR Target.
Enzyme Mix 2 (tapón azul): 1 x 340 µl. Mezcla de enzimas para PCR Index.
Amp Mix V1-V3: 1 x 70 µl. Solo para Microbiota Solution A; amplificación de las regiones V1-V2-V3 del gen bacteriano 16S rDNA.
Amp Mix V3-V6: 1 x 70 µl. Solo para Microbiota Solution B; amplificación de las regiones V3-V4-V6 del gen bacteriano 16S rDNA.
Index Strip S1: 3 tiras. Solo para Microbiota Solution A; mezcla liofilizada de oligonucleótidos para indexación.
Index Strip S4: 3 tiras. Solo para Microbiota Solution B; mezcla liofilizada de oligonucleótidos para indexación.
Index Plate S12: placa de 96 índices, no suministrada, pero solicitable; mezcla liofilizada de oligonucleótidos para indexación de muestras amplificadas.
Material necesario no incluido
Kit de extracción de ADN genómico bacteriano, AMPure Beads XP, MiSeq Reagent Nano Kit v2 (500-cycles), PhiX Control v3, agua grado molecular, etanol y equipamiento de laboratorio específico, incluido termociclador y secuenciador MiSeq Illumina.
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![]( "AD4SEQ Microbiota Solution A / Microbiota Solution B 6")
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