Ensayo de amplificación y secuenciación dirigida para recuperar y caracterizar el genoma completo del virus respiratorio sincitial (VRS) A y B a partir de ARN extraído de muestras respiratorias positivas, utilizando reactivos del ensayo COVIDSeq de Illumina. La documentación aportada lo sitúa como una solución orientada a vigilancia viral, caracterización genómica rápida y análisis de muestras respiratorias con flujos de trabajo Illumina y análisis bioinformático específico para VRS.

Descripción Detallada

Principio de funcionamiento

El ensayo se basa en la amplificación del ARN de VRS mediante dos reacciones paralelas de RT-PCR por muestra, seguidas de preparación de librerías, tagmentación, indexación, limpieza, cuantificación, normalización, “pool” equimolar y secuenciación. La documentación describe un panel de 39 primers distribuido en dos pools, diseñado para amplificar VRS-A y VRS-B sin necesidad de un subtipado previo, ya que ambos subtipos se cubren dentro del mismo esquema de reacción. Para muestras de baja carga viral se contempla, además, una opción con pools adicionales focalizados en los genes G y F. El control opcional mediante Bioanalyzer muestra picos de amplificación alrededor de 2000 pb y, tras la preparación de librería, un pico esperado alrededor de 330 pb.

Aplicaciones clínicas

Este ensayo está orientado a la detección y caracterización genómica de VRS-A y VRS-B directamente a partir de muestras primarias, especialmente hisopos nasofaríngeos positivos, para vigilancia viral, monitorización de la circulación de variantes y apoyo a investigaciones de brotes.

Beneficios

Frente a los enfoques históricos basados en cultivo, la secuenciación dirigida descrita permite obtener resultados de forma más rápida y directamente desde la muestra, evitando retrasos y posibles sesgos por adaptación en cultivo. El ensayo basado en amplicones resulta simple, estandarizable y adaptable a nuevas dianas; además, en el caso del protocolo RSV, permite cubrir el genoma completo con solo dos PCR paralelas y sin necesidad de sustituir los cebadores para distinguir previamente entre VRS-A y VRS-B.

Resultados o indicadores clave

Este ensayo para VRS ha demostrado un rendimiento sólido y consistente en la detección y caracterización de VRS-A y VRS-B, tanto en muestras artificiales como en hisopos nasofaríngeos positivos. Su enfoque dirigido permite recuperar información genómica de alta calidad directamente a partir de muestras respiratorias, con una cobertura robusta en distintos contextos de carga viral y con la posibilidad de adaptar la estrategia a regiones clave del virus cuando se requiere un abordaje más focalizado. En conjunto, se trata de una solución especialmente valiosa para la vigilancia molecular del VRS y para estudios de caracterización genómica en este tipo de virus respiratorios.

Tecnología utilizada

Este ensayo para VRS se apoya en un flujo de trabajo integrado y estandarizado que facilita no solo la amplificación y caracterización del virus, sino también una interpretación bioinformática específica para VRS-A y VRS-B mediante el uso de la herramienta DRAGEN Microbial Amplicon disponible en BaseSpace Sequence Hub. Su planteamiento permite obtener secuencias consenso y una caracterización molecular útil para vigilancia viral, seguimiento de linajes y generación de información accionable a partir de muestras respiratorias. En conjunto, ofrece una solución sólida, adaptable y especialmente interesante para laboratorios que buscan una aproximación completa al estudio genómico del VRS.

Consideraciones o limitaciones

El producto es para uso exclusivo en investigación y no debe emplearse en procedimientos diagnósticos. Para este ensayo de VRS, se han documentado buenos resultados con una gran diversidad de protocolos de extracción (QIAamp Viral RNA Mini Kit, QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Mini o Midi Kit, Magnapure, eMag, EasyMag, EZ1 DSP Virus kit y MagLead Virus extraction).

Aspectos Clave

Amplificación y secuenciación del genoma completo de VRS-A y VRS-B con reactivos Illumina COVIDSeq.
Cobertura de ambos subtipos sin necesidad de subtipado previo.
Panel de 39 primers repartido en dos pools, con opción adicional para genes G y F en muestras de baja carga viral.
Flujo de trabajo documentado con RT-PCR, preparación de librerías, tagmentación, indexación, normalización y secuenciación paired-end 2 × 151 pb.
Resultados de alta calidad en MiSeq i100 Plus, con >93% PF, Q30 >84% y tiempos combinados de corrida y análisis inferiores a 10 horas.
Análisis compatible con DRAGEN y con pipeline específico para RSV con salida de tipado, consensos FASTA e informe bioinformático.

Detalles de Presentación

Formato

Protocolo de secuenciación dirigida para VRS basado en reactivos Illumina COVIDSeq. Incluye 39 cebadores en 2 pools para genoma completo; opción de 2 pools adicionales para regiones G y F en muestras de baja carga viral.

Contenido del kit
El contenido se distribuye en varias cajas que incluyen reactivos como Illumina Tune Beads (ITB), Stop Tagment Buffer 2 (ST2), Enrichment BLT (EBLTS), Elution Buffer (ELB), Resuspension Buffer (RSB), Tagmentation Wash Buffer (TWB), COVIDSeq Primer Pool 1 (CPP1), COVIDSeq Primer Pool 2 (CPP2), Elution Prime Fragment 3HC Mix (EPH3), Enhanced PCR Mix (EPM), First Strand Mix (FSM), Illumina PCR Mix (IPM), Reverse Transcriptase (RVT) y Tagmentation Buffer 1 (TB1), además de los índices IDT for Illumina-PCR Indexes.
Referencias
Illumina COVIDSeq Assay (96 Samples) —
Illumina COVIDSeq Assay Box 1 – 96 Samples Part # 20051272
Illumina COVIDSeq Assay Box 2 – 96 Samples Part # 20051273
Illumina COVIDSeq Assay Box 3 – 96 Samples Part # 20051274
Illumina COVIDSeq Assay Box 4 – 96 Samples, Indexes —
Illumina COVIDSeq Positive Control HT Part # 20051775
Illumina COVIDSeq Test (RUO) Kit Contents (3072 Samples) —
Illumina COVIDSeq Test Box 1 – 3072 Samples Part # 20044405
Illumina COVIDSeq Test Box 2 – 3072 Samples Part # 20044406
Illumina COVIDSeq Test Box 3 – 3072 Samples Part # 20044407
Illumina COVIDSeq Positive Control HT Part # 20043401
IDT for Illumina-PCR Indexes —
IDT for Illumina-PCR Indexes Set 1 (96 Indexes) Part # 20043132
IDT for Illumina-PCR Indexes Set 2 (96 Indexes) Part # 20043132
IDT for Illumina-PCR Indexes Set 3 (96 Indexes) Part # 20043132
IDT for Illumina-PCR Indexes Set 4 (96 Indexes) Part # 20043132
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Área:

Microbiología, Virus

Marca:

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