Illumina Microbial Amplicon Prep–Influenza A/B (IMAP-Flu)

Flujo de preparación de librerías dirigidas para la secuenciación del genoma completo de influenza A e influenza B a partir de ARN total en sistemas Illumina. Permite preparar hasta 48 librerías con índices duales únicos y generar librerías listas para secuenciación en menos de 9 horas.

Descripción Detallada

Principio de funcionamiento

El flujo IMAP-Flu utiliza un pool de 16 cebadores Influenza A/B Primer Pool para hibridar con los extremos 3’ de los segmentos de ARN genómico y del cDNA, permitiendo tanto la síntesis de cDNA como la amplificación posterior por PCR para generar amplicones de genoma completo listos para tagmentación. Se indica que amplifica los 8 segmentos de ARN genómico de cada muestra. Tras la amplificación, los amplicones se fragmentan y etiquetan mediante tagmentación con EBLTS. Después, una PCR de indexación añade índices duales únicos de 10 pb para i7 e i5, junto con las secuencias necesarias para la generación de clústeres de secuenciación.

Beneficios

Preparación de hasta 48 librerías dual-indexadas únicas. Flujo escalable de 1 a 48 muestras. Generación de librerías listas para secuenciación en menos de 9 horas. Ensayo para influenza A e influenza B, con capacidad de análisis de subtipos de ambos virus.

Resultados o indicadores clave

El resultado del flujo es una librería dirigida del genoma completo de influenza A/B a partir de ARN, preparada para secuenciación en sistemas Illumina. Illumina recomienda muestras con Ct < 30 para obtener alta profundidad de secuenciación y cobertura completa del genoma. Para la cuantificación y normalización, la documentación indica analizar 2 µl del pool con Qubit dsDNA HS Assay Kit y normalizar la librería a 4 nM, con un volumen mínimo de 30 µl. El tamaño medio de librería usado para el cálculo de molaridad se sitúa en torno a 400 pb. Capacidades máximas de secuenciación con cartuchos de 300 ciclos de iSeq y MiSeq: iSeq hasta 20 muestras; MiSeq Nano v2 hasta 5, Micro v2 hasta 20 y Standard v2 hasta 72 muestras. También se indica posibilidad de uso con MiniSeq y NextSeq. En la documentación de Illumina se aporta, como ejemplo de pooling normalizado con 1 millón de lecturas paired-end por muestra, una capacidad de 8 muestras en iSeq 100 v1/v2, 30 en MiSeq v2, 48 en MiniSeq HO y 384 en NextSeq 500/550 HO empleando múltiples kits e índices adicionales.

Tecnología utilizada

RT-PCR universal de genoma completo para influenza A/B. Tagmentación de amplicones con adición de adaptadores. PCR de indexación con índices duales únicos. Cuantificación por Qubit y normalización previa a secuenciación.

Consideraciones o limitaciones

Los resultados pueden variar en función de la carga viral y no están garantizados. Para maximizar el éxito de la preparación de librerías, se recomiendan muestras de ARN con relaciones A260/280 y A260/230 de 2,0–2,2. Valores fuera de ese rango pueden indicar contaminantes y provocar fallo del ensayo. La documentación indica que el protocolo ha sido optimizado y validado con consumibles y equipos concretos, y que no se garantiza un rendimiento comparable con alternativas. El kit no debe someterse a más de 8 ciclos de congelación/descongelación. Se recomienda trabajar en un entorno libre de RNasas/DNasas, usar controles negativos y evitar contaminación por arrastre de amplicones. Las librerías pooleadas son estables hasta 30 días a -25 °C a -15 °C.

Aspectos Clave

Secuenciación dirigida del genoma completo de influenza A/B a partir de ARN total.

Hasta 48 librerías dual-indexadas únicas por kit.

Flujo de preparación escalable de 1 a 48 muestras.

Librerías listas para secuenciación en menos de 9 horas.

Pool de 16 cebadores para la amplificación universal del genoma completo.

Recomendación de Ct < 30 para mayor profundidad y cobertura completa.

Detalles de Presentación

Formato

Kit de preparación de librerías para 48 muestras, distribuido en cinco cajas.

Contenido del kit

Box 1 (temperatura ambiente), componente #20093449: IPB (Illumina Purification Beads) y ST2 (Stop Tagment Buffer 2). Box 2 (2 °C a 8 °C), componente #20093450: EBLTS (Enrichment BLT), TWB (Tagmentation Wash Buffer) y ELB (Elution Buffer). Box 3 (-25 °C a -15 °C), componente #20093451: EPH3, EPM, FSM, IPM, RSB, RVT y TB1. La documentación indica que EPH3 no se utiliza en el protocolo IMAP-Flu. Illumina Unique Dual Indexes, LT, caja #20083060: 1 set de índices duales únicos. Influenza A/B Primer Pool, caja #20108095: 1 IPP (Influenza A/B Primer Pool).

Condiciones de conservación

Reactivos repartidos entre almacenamiento a temperatura ambiente, refrigeración y congelación según el componente.

Área:

Microbiología, Virus

Tecnología:

Secuenciación masiva (NGS)

Marca:

Illumina

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